TAREAS HABITUALES DEL TÉCNICO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA. PARTE 1: RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

Cuando el laboratorio recibe una muestra para analizar se procederá de la siguiente manera:

1) La fijaremos en formol en proporción 1:20 para detener los fenómenos de autólisis y putrefacción derivadas de la muerte celular con el fin de minimizar los cambios en su estructura y lograr que el patólogo pueda valorarla.

corazones de cordero fijados en formol

2) Mientras se completa el proceso de fijación, procederemos al registro de la muetra.
Se reflejara, de forma inmediata, en el libro de registros del laboratorio la filiación del paciente, el servicio de procedencia y la fecha y hora de procedencia del material. Imprescindible otorgar a cada muestra un número correlativo por orden de recepción.

3) Una vez tenemos nuestra muestra totalmente fijada continuamos con su preparación. Dependiendo del tipo de muestra se procederá a abrirla y vaciar su contenido en un recipiente de medición, extraer el líquido de los quistes y sustituirlo por líquido fijador.

4) Tallado. Es en este paso donde se realiza el estudio macroscópico de la muestra, la descripción de esta detalladamente (dimensiones, lesiones, morfología, aspecto, coloración...) y por último la selección de las áreas representativas.
Los fragmentos tienen que tener un tamaño no superior a 3/5 mm de espesor para facilitar la infiltración de la parafina.
Posteriormente se introducirán en cestillas.

selección de áreas representativas.

bisturí. 

cestillas.

 5) En el caso de que se requiera, se le aplicará a la muestra un decalcificante (a excepción de Bouin, líquido decalcificante y fijador).






Continuación en parte 2..

TAREAS HABITUALES DEL TÉCNICO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA. PARTE 2. INFILTRACIÓN EN PARAFINA.

Comenzamos el protocolo con la fijación en formaldehido al 4%, la cual se encarga de detener los procesos de autolisis y putrefacción.

En segundo lugar introduciremos los fragmentos de tejido en casetes identificados para posteriormente pasarlos a la procesadora.

Procesadora.

En este aparato se llevaran a cabo las siguientes etapas:

 - Final de la fijación: El formol termina de infiltrarse en el tejido.

 - Deshidratación: Mediante una serie de alcoholes en graduación creciente se elimina el agua del tejido para su mejor conservación.

 - Aclaramiento: Dos baños de xilol se encargan de eliminar el alcohol de la muestra, ya que no es miscible con la parafina.

 - Infiltración: Se sumerge el tejido en dos baños de parafina líquida caliente para que esta se infiltre en el tejido.

Tabla explicativa.

Cálculo de concentraciones alcohol-agua.

  - 70%: (70·200)/100=140 ml OH y enrasar con H2O hasta 200 ml.

  - 80%: (80·200)/100=160 ml OH y enrasar con H2O hasta 200 ml.

  - 96%: (96·200)/100=192 ml OH y enrasar con H2O hasta 200 ml.

  - 100%: (100·200)/100=200 ml OH.

Para finalizar, extraemos el cestillo de la procesadora.

Cestillo de la procesadora con las muestras en sus casetes.

Trasladamos los casetes a la estación de confección de bloques y llevamos el cestillo de la procesadora a la estufa para limpiar la parafina..

TAREAS HABITUALES DEL TÉCNICO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA. PARTE 3. CONFECCIÓN DEL BLOQUE.

La estación de confección de bloques de parafina tiene como finalidad  solidificar la muestra  a fin de proporcionarle la consistencia y homogeniedad adecuadas para obtener secciones translúcidadas muy delgadas aptas para la coloración y observación microscópica.

Estación de inclusión en parafina.

Los pasos a seguir normalmente son:

1)Cogemos las muestra ya embebida en parafina del casete, situado en la parte izquierda del aparato (una zona caliente).
Desechamos la tapa e introducimos los fragmentos de tejido en un molde metálico adecuado a su tamaño.

Abrimos el casete para sacar la muestra.

2) Se debe orientar las muestras de forma correcta teniendo en cuenta su posterior corte.
Colocar el molde bajo el dispensador de parafina líquida. Regular adecuadamente la cantidad de parafina que se desea para cada momento.
En este caso solo deseamos crear una fina capa de parafina en el fondo.

Aplicación de la base de parafina.

3) Trasladamos el molde a la zona fría y presionamos con las pinzas ligeramente, le colocamos el casete de la forma indicada en la fotografía y, sujetándolo en el aire sin tocar de nuevo la zona caliente, se rellena hasta arriba de parafina.

Añadir leyenda

4) Por último lo trasladamos a la placa fría para su solidificación.

Dispensador de parafina rellenando un molde y placa de frío.

Antes de retirar el molde metálico, debemos de asegurarnos que la parafina está sólida, de lo contrario se estropearía el bloque.

 *Son necesarios el mantenimiento y limpieza de los instrumentos (eliminación de tejidos y parafina)..

TAREAS HABITUALES DEL TÉCNICO EN ANATOMÍA PATOLÓGICA. PARTE 4. EL MICROTOMO.

Un microtomo es un instrumento que provoca el corte gracias a una transformación de un movimiento de rotación en otro de ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada del portabloques se produce un acercamiento hacia la cuchilla según el espesor del corte seleccionado.

Microtomo de rotación de cara y perfil.

Procederemos a enumerar las diferentes partes del microtomo:

a) Cuchilla fija a un pedestal

b) Bloque de inclusión (parafina o celoidina) fijado a un brazo móvil en la vertical.

c) La pinza portabloques efectúa un  movimiento vertical delante del filo de la cuchilla (gracias al movimiento del volante)

d) Un volante movido a mano da la oscilación vertical y la regularidad.

e) Un sistema de ruedas dentadas regulares asegura el avance o retroceso del bloque. Se encarga de la igualdad de grosor de los cortes.

Pinza de sujeción del bloque.

Cuchilla.

Material necesario: 
1)Pinzas, de punta gruesa y fina.
2) Punzón.
3) Pinceles.
4) Brocha.
5) Palancana con hielos.
6) Cuenco con agua fría.

7) Baño de agua caliente (50ºC). Es recomendable tener un termómetro para controlar su temperatura.

Material necesario.

Pasos a seguir:
1) Dejar enfriar el bloque en la palancana con hielos.
2) Montar ajustar el bloque sobre el microtomo y preparar la cuchilla.
3) Desbastado de la muestra a 15 micras para dejar la superficie totalmente lisa.
4) Volver a dejar enfriar el bloque.

5) Una vez enfriado y vuelto a colocar, se pueden obtener mediante el corte secciones individuales o seriadas unidas por las caras paralelas a la cuchillas.

6) Manipularlas con pinceles o lancetas.
7)Corta fragmentos de la cinta que contengan 1 o 3 cortes.
8) Llevar las tiras hasta el baño de agua fría para que se extiendan (hidrofobia de la parafina).

9) Recogerlos con un porta y llevarlos a otro baño con agua caliente.

10) Recoge sobre el porta definitivo orientándolo como proceda.

11) Apoyar el porta sobre una placa calefactora (el borde del baño) durante 10 minutos para que se adhiera el pegamento.
12) Si es posible deja los cortes en la estufa overnight para que se sequen y adhieran completamente.

Muestra enfriándose en palancana con hielos.

Alumno cortando con el microtomo de rotación.

Ventajas e inconvenientes del microtomo de rotación:
- Ventajas: Muy preciso. Permite obtener cortes/secciones seriados muy finos.
-  Inconvenientes: Es muy caro. No permite cortar tejidos incluidos en celoidina, gelatina ni propilenglicol.

PROTOCOLO DE TINCIONES I HEMATOXILINA EOSINA.

Esta tinción es una de las más utilizadas en laboratorios de anatomía patológica.
Consta de dos colorantes:

• Hematoxilina

De carácter catiónico o básica, por lo que tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura.

• Eosina.

Tiñe componentes básicos (acidofilas) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida.

Reactivos ematoxilina y eosina.

Estructuras que tiñe:

• Núcleo celular: Violeta
• Citoplasma: Rosa
• Musculatura: Rojo , rosa o fucsia
• Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado
• Fibrina: Rosa

Protocolo:

1) Previamente tendremos que elaborar un filtro para la hematoxilina.

2) Desparafinar las muestras.
Este paso se realiza en dos tandas: la primera en la estufa 60ºC durante 10 min y posteriormente líquido intermedio, Xilol, tres baños de 10 min cada uno.
Asegurarse durante todo el proceso que los diferentes reactivos cubran por completo las muestras de no ser así, agitar el cestillo con las muestras de forma vertical, de arriba a abajo.
Una vez finalizado este paso, no olvidar escurrir el cestillo en papel empapante con la intención de evitar contaminar los diferentes reactivos.

Estufa.

Muestras en la estiua a 60ºC

3) Hidratar con una batería de alcoholes a concentraciones decrecientes (de 100% al 50%) tres minutos por cada coplin de alcohol.
Ir observando la superficie del cristal.

Un par de coplins de alcoholes.

4) Agua, en nuestro caso la utilizamos del grifo ya que el agua de Valencia es rica en calcio.
En este paso es imprescindible prestar atención a la superficie del cristal. Agitar enérgicamente el cestillo hasta que en esta no se encuentre uniforme.

5) Hematoxilina, tiempo estimado de 3-5 min.
Unos segundos antes de que finalice el tiempo tendremos que transportar el coplin con la hematoxilina y las muestras a la pila, donde pasaremos el cestillo a otro coplin y rellenaremos este de agua del grifo a chorro constante hasta que el agua salga transparente. 

Hematoxilina en la pila con el chorro de agua cayendo.

Tener la precaución de evitar que el chorro de agua no incida directamente en las muestras, ya que esto podría dañar las muestras.

El chorro a un lado sin dañar las muesttras

Añadir agua hasta que salga transparente.

 Una vez el agua del coplin se aprecie transparente se trasladará de nuevo a la mesa de tinción para continuar con el protocolo.

6) Diferenciación con ácido clorhídrico.
En este caso, la estancia de las muestras en el reactivo sera muy rápida.

7) Neutralización con bicarbonato.
Debido a nuestra localización geográfica,en nuestro laboratorio utilizamos agua del grifo.

8) Eosina, de 30 segundos a 3 min.

9) Lavar en agua corriente.
Este proceso también será con la mayor rapidez posible, de lo contrario se podría perder el color.

10) Deshidratación a concentraciones crecientes de alcohol (del 50% al 100%).
Desde los 50-96% las muestras estarán en contacto con el líquido una vez durante 30 segundos, mientras que al 100% se dejarán reposar las muestras en tres coplins diferentes durante 10 min cada uno.

11) Líquidos intermedios, Xilol.
Tres coplins diferentes y cinco min por coplin.

12) Para finalizar montaremos las muestras con líquido de montaje Eukitt.

Líquido de montaje.

Muestras recién montadas.

Protocolo esquemático:

PROTOCOLO DE TINCIONES II TRICRÓMICO DE MASSON.

Es una técnica de coloración especial que permite visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I,,, también evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares.
En esta técnica se emplean tres colorantes para diferenciar el núcleo celular, el citoplasma y las fibras de colágeno: Hematoxilina, fuxina de Ponceau y azul de Anilina.

Mesa de tinción tricrómico.

• Núcleos: AZUL OSCURO 
• Citoplasmas, queratina, fibras musculares, eritrocitos: ROJO (rosado) 
• Colágeno y fibras de reticulina (colágeno III): AZUL CLARO o verde (depende del colorante)

Protocolo:

1) Desparafinación en la estufa 60ºC durante 10 min y posteriormente en líquido intermediario, Xilol, en tres coplins diferentes durante 5 min cada uno.

2) Hidratación con alcoholes en concentraciones decrecientes, del 96%, 80% y 60%, un min cada uno.

3) Lavar con agua corriente.

Es conveniente mirar la superficie de los cristales para asegurarse de que la muestra está totalmente hidratada.

4) Hematoxilina durante 5 min.

Previamente filtrada.

Unos segundos antes de que acabe el proceso trasladar el coplin a la pila, rellenar otro coplin con agua del grifo donde depositaremos las muestras y aplicaremos el chorro de agua hasta que el esta salga transparente.

Chorro de agua incidiendo en esquina del coplin.

Posteriormente volver a la bancada de tinciones con el coplin y las muestras.

5) Fucsina de Ponceau 5 min.

A continuación se aplicará un baño de agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante y después otro de agua acética 1% muy rápido.

6) Ácido fosfomolibdico 5 min.

Posteriormente baño en agua acética 1%

7) Azul de Anilina 10 min.

A continuación se aplicará un baño de agua corriente.

Después otro de agua acética 1%.

Y para finalizar agua corriente.

8) Deshidratar con alcoholes a concentración creciente, 60%, 60% y 80% rápido y un baño de 100% durante 5 min.

9) Xilol tres pasos de 5 min cada uno.

10) Medio de montaje.


Esquema:

PROTOCOLO DE TINCIONES III MAY-GRÜNWALD GIEMSA (MGG)

La tinción de May-Grünwald Giemsa es utilizada por la mayor parte de los citólogos que estudian preparaciones por PAAF.


Esta técnica combina los principios de coloraciones desarrollados por May-Grünwald y Giemsa, usando 2 soluciones colorantes:

a) Solución May-Grünwald: Contiene eosina (colorante aniónico/ácido) y azul de metileno (colorante catiónico), en solución alcohólico, concretamente disueltos en metanol.

b) Solución Giemsa: Contiene Eosina, azul de metileno y productos derivados de la oxidación del azul de metileno.

 

Los componentes celulares se clasifican por esta tinción en:

a) Componentes anióncos (ácidos): al unirse a los tintes catiónicos se tiñen en tonos azules.
Serán estructuras basófilas.
 
b) Componentes catiónicos (básicos): se unirán a la eosina, tiñendo en varios tonos rojizos o anaranjados.
Son los componentes acidófilos o eosinófilos.

Estructuras que tiñe:

•  Núcleos: azul púrpura 
•  Citoplasmas: violeta pálido o marrón. 
•  Si la aplicamos sobre sangre, veremos: 
•  Gránulos de los neutrófilos: violeta marrón 
•  Gránulos de los eosinófilos: naranja 
•  Gránulos de los basófilos: azul-negro 
•  Gránulos de linfocitos: púrpura 

 Protocolo:
 
1) Prepararemos una bandeja con varillas para apoyar las extensiones citológicas.

2) Fijación: Aplicar a los frotis secos (secados al aire) con una micropipeta solución de May-Grünwald durante 3 minutos.

3) Sin lavar, aplicar agua destilada para diluir la solución de May-gründwald*1 y dejar actuar otros 3 minutos.

4) Giemsa: Sin lavar, escurrir el colorante sobre la preparación y aplicar solución de Giemsa durante 20 minutos. Retirar y escurrir.

5) Lavar el frotis con abundante agua destilada.

6) Limpiar el dorso de la preparación.

7) Secar al aire dejando las preparaciones inclinadas con un ángulo de unos 45º y la extensión por la parte interior (minimizamos “gotas” sobre la muestra). 

8) Montar de la manera habitual.

 *Debemos saber que la solución de May-Grünwald se prepara a partir de MG comercial en polvo, a una concentración del 0,25% en metanol (P/V) y la solución extemporánea de Giemsa se preparar a partir de Giemsa comercial líquido, a razón de 1 gota por cm3.
 

Esqema: 

PROTOCOLO DE TINCIONES IV PANÓPTICO RÁPIDO

Se utiliza principalmente para la tinción de frotis sanguíneos, y en AP para las PAAFs.
Esta técnica permite diferenciar los principales tipos celulares que encontramos en sangre o en citologías.


Se comercializa como un kit que incluye 3 líquidos diferentes:

1.  Líquido 1 FIJADOR: Solución alcohólica de triarilmetano.
2.  Líquido 2 Colorante ÁCIDO (rojo): Solución tamponada de xanteno.
3.  Líquido 3 Colorante BÁSCIO (azul): Solución tamponada de tiazina.

Reactivos.

a) Los colorantes catiónicos (básicos) se unirán a las estructuras ácidas-basófilas, y quedaran en onos azulados.
b) Los colorantes aniónicos (ácidos) –fundamentalmente la eosina- se unirá a las estructuras básicas-acidófilas-eosinófilas.
c) Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes, quedaran en tonos
violeta.


Resultado en muestras hematológicas:

•  Eritrocitos: color rosa pálido a beige.
•  Plaquetas: color violeta claro.
•  Neutrófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta claro con gránulos violeta oscuro.
•  Basófilos: núcleo violeta oscuro, gránulos violeta oscuro.
•  Eosinófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta con gránulos rojizos- violeta.
•  Linfocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.
•  Monocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.

Citología

Protocolo para extensiones de sedimento urinario:

1) Obtener orina en un bote de recogida (bote de boca ancha con tapón habitualmente verde o rojo).

2) Descartar la primera parte de la micción y recoger el resto.

3) Tomar 8 mL de orina y transferirlos a un tubo de centrífuga.

4) Centrifugar a 1500-2000 rpm durante 10 minutos.

5) Eliminar el sobrenadante (con una pipeta pasteur iremos eliminando progresivamente y lo
devolveremos al bote de orina).

6) La última gota la usaremos para resuspender el sedimento, lo recuperaremos SIN DESPEGAR LOS DEDOS TOTALMENTE DE LA PIPETA, y la depositaremos sobre un porta, cerca del extremo.

7) Con ayuda de otro porta, la extenderemos.

8) Dejamos secar al aire.

9) Teñimos con panóptico rápido.

Protocolo tinción:

1)  Realizaremos una buena extensión de sangre/orina, que dejaremos secar al aire.

2) Preparamos la batería de tinción etiquetando tres cubetas Coplin, que llenamos con los líquidos del kit en el orden establecido o cuatro cubetas en el caso que deseemos lavar con agua en esta última.

Reactivo 1: Fijación: 5 inmersiones de 1 segundo (introducir el porta en la cubeta durante un segundo y sacar, repetir 5 veces), escurrir en papel empapante.

Reactivo 2: 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir en papel empapante.

Reactivo 3: 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir en papel empapante.

3) Lavado: Ponemos el porta bajo el chorro del agua, de manera que no incida directamente sobre las células para no deteriorar la extensión o sumergimos en la cuarta cubeta llena de agua.

4) Secado: al aire, posición 45º inclinada y con la extensión hacia la cara interior.
No es necesario montar. Si se desea conservar, llevar a xilol y montar con resina (Eukit).

Esquema: 

PROTOCOLO DE TINCIONES V PAPANICOLAU (PAP)

La tinción policrómica de Papanicolaou, ha sido y sigue siendo la tinción de rutina por excelencia para citología y citopatología.

Reactivos:

1) Hematoxilina:
Colorante básico que tiñe el núcleo por el carácter ácido que le proporcionan los ácidos nucleicos. Tiñe principalmente el núcleo de las células, y el citoplasma queda ligeramente manchado.

2) Orange G:
Colorante ácido que tiñe el citoplasma de algunas células que son un poco más densas, como las queratinizadas y los hematíes (por la hemoglobina que contienen). Los citoplasmas quedan teñidos de tonos naranjas.
Cuanto más anaranjado quede teñido el citoplasma, más “vieja” y terminal es la célula.

Resultado:

• Núcleos celulares : azules, negros, a veces violeta oscuro. 
• Cromatina nuclear: azul. 
• Núcleos de leucocitos (generalmente macrófagos): azul oscuro (los citoplasmas no se aprecian). 
• Citoplasma de las células eosinófilas superficiales (y acidófilas en general): rosa, a veces rosarojizo/anaranjado. 
• Citoplasma de las células con queratina: rojo-anaranjado o naranja. 
• Citoplasma de las células cianófilas intermedias o superficiales (basófilos): azul, a veces verdoso. 
• Eritrocitos : rojos. 

Protocolo:

Previamente tendremos que elaborar un filtro para filtrar la hematoxilina.
Utilizaremos células de muestra vaginal que citocentrifugaremos.
Fijaremos en etanol 96ºC durante 15-30 minutos.

Citocentrífuga.

A continuación aplicaremos la tinción:

1) Hidratar con una batería de alcoholes a concertaciones decrecientes (de 100% a 50%) tres minutos por cada coplin de alcohol, ir observando la superficie del cristal.

2) Agua, utilizaremos la del grifo ya que el agua de valencia es rica en cal. Será muy importante observar la superficie del cristal, hasta que este quede uniforme.

3) Hematoxilina de Harris. De 3 a 5 minutos (depende de su maduración).
Unos minutos antes de que finalice el tiempo, tendremos que transportar el coplin con la hematoxilina y las muestras a la pila, donde pasaremos el cestillo a otro coplin que llenaremos con agua del grifo a chorro constante (sin que incida directamente sobre la muestra) hasta que el agua salga trasparente, es entonces cuando lo llevaremos de vuelta a la mesa de tinción.

4) Diferenciar con alcohol clorhídrico 5 segundos.

5) Neutralizar con Carbonato de Litio 45 segundos o en nuestro caso, al tener aguas tan ricas en calcio, utilizaremos agua del grifo.

6) Lavar con agua del grifo rápidamente ya que de no ser así podrían haber perdidas de color.

7) Deshidratar con alcoholes a concentraciones crecientes (del 50% a 100%) dejaremos actuar en cada coplin 30 segundos, mientras que en los alcohol al 100% dejaremos actuar 10 minutos cada uno.

8) Orange G, de 3-6 min o 3 pases de 2 min.

9) Alcohol al 96% 2 pases de 1 min.

10) EA-50 o 65 de 3-6 minutos.

11) Etanol 96º 2 pases de 1 minuto.

12) Xilol 2 pases de 1 minuto.

13) Montar con Eukit.

Esquema:

PROTOCOLO TINCIONES VI GIEMSA

Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas.

Resultados:

• Eritrocitos: Rojo ladrillo
• Núcleos celulares: Morado
• Granulaciones especificas: Rojo, rosa o morado
• Citoplasmas: De rosa al azul (efecto giemsa)
• Hueso: Azul
• Bacterias y parásitos: Azul, menos las rikettsias que se ven violetas

Protocolo:

1) Desparafinar.
En la estufa 10 min a 60ºC o toda la noche a 37ºC.

2) Líquido intermediario, Xiol.

3) Hidratar aplicando alcoholes en concentraciones decrecientes (96% - 50%).

4) Sumergir en agua destilada (o de grifo) para que la muestra se hidrate, ya que la mayoría de los tintes tienen una base acuosa.

5) Solución de Giemsa (filtrada y comercial, o al 30% en agua destilada) durante 1 hora, a Tª ambiente.

6) Se lava con agua hasta que rebose.

7) Lavar con agua acética al 2% varias veces rápidamente, aunque puede llegar hasta 30 segundos (diferenciación)

8) Se lava con agua corriente hasta que rebose

9) Deshidratar con alcohol isopropílico (propanol) (2 cambios al menos) No usar etanol.

10) Se sumerge en las distintas cubetas de xilol durante 5 minutos cada una.

11) Tras este proceso, ya se puede montar
En el montaje, la muestra teñida y humedecida (del coplin de xilol) se cubre con un cristal (cubre) que se pega con producto llamado Entellan, intentando la formación de burbujas de aire, lo que daría lugar a artefactos al observar en el microscopio.