PROTOCOLO DE TINCIONES II TRICRÓMICO DE MASSON.

Es una técnica de coloración especial que permite visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I,,, también evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares.
En esta técnica se emplean tres colorantes para diferenciar el núcleo celular, el citoplasma y las fibras de colágeno: Hematoxilina, fuxina de Ponceau y azul de Anilina.

Mesa de tinción tricrómico.

• Núcleos: AZUL OSCURO 
• Citoplasmas, queratina, fibras musculares, eritrocitos: ROJO (rosado) 
• Colágeno y fibras de reticulina (colágeno III): AZUL CLARO o verde (depende del colorante)

Protocolo:

1) Desparafinación en la estufa 60ºC durante 10 min y posteriormente en líquido intermediario, Xilol, en tres coplins diferentes durante 5 min cada uno.

2) Hidratación con alcoholes en concentraciones decrecientes, del 96%, 80% y 60%, un min cada uno.

3) Lavar con agua corriente.

Es conveniente mirar la superficie de los cristales para asegurarse de que la muestra está totalmente hidratada.

4) Hematoxilina durante 5 min.

Previamente filtrada.

Unos segundos antes de que acabe el proceso trasladar el coplin a la pila, rellenar otro coplin con agua del grifo donde depositaremos las muestras y aplicaremos el chorro de agua hasta que el esta salga transparente.

Chorro de agua incidiendo en esquina del coplin.

Posteriormente volver a la bancada de tinciones con el coplin y las muestras.

5) Fucsina de Ponceau 5 min.

A continuación se aplicará un baño de agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante y después otro de agua acética 1% muy rápido.

6) Ácido fosfomolibdico 5 min.

Posteriormente baño en agua acética 1%

7) Azul de Anilina 10 min.

A continuación se aplicará un baño de agua corriente.

Después otro de agua acética 1%.

Y para finalizar agua corriente.

8) Deshidratar con alcoholes a concentración creciente, 60%, 60% y 80% rápido y un baño de 100% durante 5 min.

9) Xilol tres pasos de 5 min cada uno.

10) Medio de montaje.


Esquema:

PROTOCOLO DE TINCIONES III MAY-GRÜNWALD GIEMSA (MGG)

La tinción de May-Grünwald Giemsa es utilizada por la mayor parte de los citólogos que estudian preparaciones por PAAF.


Esta técnica combina los principios de coloraciones desarrollados por May-Grünwald y Giemsa, usando 2 soluciones colorantes:

a) Solución May-Grünwald: Contiene eosina (colorante aniónico/ácido) y azul de metileno (colorante catiónico), en solución alcohólico, concretamente disueltos en metanol.

b) Solución Giemsa: Contiene Eosina, azul de metileno y productos derivados de la oxidación del azul de metileno.

 

Los componentes celulares se clasifican por esta tinción en:

a) Componentes anióncos (ácidos): al unirse a los tintes catiónicos se tiñen en tonos azules.
Serán estructuras basófilas.
 
b) Componentes catiónicos (básicos): se unirán a la eosina, tiñendo en varios tonos rojizos o anaranjados.
Son los componentes acidófilos o eosinófilos.

Estructuras que tiñe:

•  Núcleos: azul púrpura 
•  Citoplasmas: violeta pálido o marrón. 
•  Si la aplicamos sobre sangre, veremos: 
•  Gránulos de los neutrófilos: violeta marrón 
•  Gránulos de los eosinófilos: naranja 
•  Gránulos de los basófilos: azul-negro 
•  Gránulos de linfocitos: púrpura 

 Protocolo:
 
1) Prepararemos una bandeja con varillas para apoyar las extensiones citológicas.

2) Fijación: Aplicar a los frotis secos (secados al aire) con una micropipeta solución de May-Grünwald durante 3 minutos.

3) Sin lavar, aplicar agua destilada para diluir la solución de May-gründwald*1 y dejar actuar otros 3 minutos.

4) Giemsa: Sin lavar, escurrir el colorante sobre la preparación y aplicar solución de Giemsa durante 20 minutos. Retirar y escurrir.

5) Lavar el frotis con abundante agua destilada.

6) Limpiar el dorso de la preparación.

7) Secar al aire dejando las preparaciones inclinadas con un ángulo de unos 45º y la extensión por la parte interior (minimizamos “gotas” sobre la muestra). 

8) Montar de la manera habitual.

 *Debemos saber que la solución de May-Grünwald se prepara a partir de MG comercial en polvo, a una concentración del 0,25% en metanol (P/V) y la solución extemporánea de Giemsa se preparar a partir de Giemsa comercial líquido, a razón de 1 gota por cm3.
 

Esqema: 

PROTOCOLO DE TINCIONES IV PANÓPTICO RÁPIDO

Se utiliza principalmente para la tinción de frotis sanguíneos, y en AP para las PAAFs.
Esta técnica permite diferenciar los principales tipos celulares que encontramos en sangre o en citologías.


Se comercializa como un kit que incluye 3 líquidos diferentes:

1.  Líquido 1 FIJADOR: Solución alcohólica de triarilmetano.
2.  Líquido 2 Colorante ÁCIDO (rojo): Solución tamponada de xanteno.
3.  Líquido 3 Colorante BÁSCIO (azul): Solución tamponada de tiazina.

Reactivos.

a) Los colorantes catiónicos (básicos) se unirán a las estructuras ácidas-basófilas, y quedaran en onos azulados.
b) Los colorantes aniónicos (ácidos) –fundamentalmente la eosina- se unirá a las estructuras básicas-acidófilas-eosinófilas.
c) Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes, quedaran en tonos
violeta.


Resultado en muestras hematológicas:

•  Eritrocitos: color rosa pálido a beige.
•  Plaquetas: color violeta claro.
•  Neutrófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta claro con gránulos violeta oscuro.
•  Basófilos: núcleo violeta oscuro, gránulos violeta oscuro.
•  Eosinófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta con gránulos rojizos- violeta.
•  Linfocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.
•  Monocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.

Citología

Protocolo para extensiones de sedimento urinario:

1) Obtener orina en un bote de recogida (bote de boca ancha con tapón habitualmente verde o rojo).

2) Descartar la primera parte de la micción y recoger el resto.

3) Tomar 8 mL de orina y transferirlos a un tubo de centrífuga.

4) Centrifugar a 1500-2000 rpm durante 10 minutos.

5) Eliminar el sobrenadante (con una pipeta pasteur iremos eliminando progresivamente y lo
devolveremos al bote de orina).

6) La última gota la usaremos para resuspender el sedimento, lo recuperaremos SIN DESPEGAR LOS DEDOS TOTALMENTE DE LA PIPETA, y la depositaremos sobre un porta, cerca del extremo.

7) Con ayuda de otro porta, la extenderemos.

8) Dejamos secar al aire.

9) Teñimos con panóptico rápido.

Protocolo tinción:

1)  Realizaremos una buena extensión de sangre/orina, que dejaremos secar al aire.

2) Preparamos la batería de tinción etiquetando tres cubetas Coplin, que llenamos con los líquidos del kit en el orden establecido o cuatro cubetas en el caso que deseemos lavar con agua en esta última.

Reactivo 1: Fijación: 5 inmersiones de 1 segundo (introducir el porta en la cubeta durante un segundo y sacar, repetir 5 veces), escurrir en papel empapante.

Reactivo 2: 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir en papel empapante.

Reactivo 3: 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir en papel empapante.

3) Lavado: Ponemos el porta bajo el chorro del agua, de manera que no incida directamente sobre las células para no deteriorar la extensión o sumergimos en la cuarta cubeta llena de agua.

4) Secado: al aire, posición 45º inclinada y con la extensión hacia la cara interior.
No es necesario montar. Si se desea conservar, llevar a xilol y montar con resina (Eukit).

Esquema: 

PROTOCOLO DE TINCIONES V PAPANICOLAU (PAP)

La tinción policrómica de Papanicolaou, ha sido y sigue siendo la tinción de rutina por excelencia para citología y citopatología.

Reactivos:

1) Hematoxilina:
Colorante básico que tiñe el núcleo por el carácter ácido que le proporcionan los ácidos nucleicos. Tiñe principalmente el núcleo de las células, y el citoplasma queda ligeramente manchado.

2) Orange G:
Colorante ácido que tiñe el citoplasma de algunas células que son un poco más densas, como las queratinizadas y los hematíes (por la hemoglobina que contienen). Los citoplasmas quedan teñidos de tonos naranjas.
Cuanto más anaranjado quede teñido el citoplasma, más “vieja” y terminal es la célula.

Resultado:

• Núcleos celulares : azules, negros, a veces violeta oscuro. 
• Cromatina nuclear: azul. 
• Núcleos de leucocitos (generalmente macrófagos): azul oscuro (los citoplasmas no se aprecian). 
• Citoplasma de las células eosinófilas superficiales (y acidófilas en general): rosa, a veces rosarojizo/anaranjado. 
• Citoplasma de las células con queratina: rojo-anaranjado o naranja. 
• Citoplasma de las células cianófilas intermedias o superficiales (basófilos): azul, a veces verdoso. 
• Eritrocitos : rojos. 

Protocolo:

Previamente tendremos que elaborar un filtro para filtrar la hematoxilina.
Utilizaremos células de muestra vaginal que citocentrifugaremos.
Fijaremos en etanol 96ºC durante 15-30 minutos.

Citocentrífuga.

A continuación aplicaremos la tinción:

1) Hidratar con una batería de alcoholes a concertaciones decrecientes (de 100% a 50%) tres minutos por cada coplin de alcohol, ir observando la superficie del cristal.

2) Agua, utilizaremos la del grifo ya que el agua de valencia es rica en cal. Será muy importante observar la superficie del cristal, hasta que este quede uniforme.

3) Hematoxilina de Harris. De 3 a 5 minutos (depende de su maduración).
Unos minutos antes de que finalice el tiempo, tendremos que transportar el coplin con la hematoxilina y las muestras a la pila, donde pasaremos el cestillo a otro coplin que llenaremos con agua del grifo a chorro constante (sin que incida directamente sobre la muestra) hasta que el agua salga trasparente, es entonces cuando lo llevaremos de vuelta a la mesa de tinción.

4) Diferenciar con alcohol clorhídrico 5 segundos.

5) Neutralizar con Carbonato de Litio 45 segundos o en nuestro caso, al tener aguas tan ricas en calcio, utilizaremos agua del grifo.

6) Lavar con agua del grifo rápidamente ya que de no ser así podrían haber perdidas de color.

7) Deshidratar con alcoholes a concentraciones crecientes (del 50% a 100%) dejaremos actuar en cada coplin 30 segundos, mientras que en los alcohol al 100% dejaremos actuar 10 minutos cada uno.

8) Orange G, de 3-6 min o 3 pases de 2 min.

9) Alcohol al 96% 2 pases de 1 min.

10) EA-50 o 65 de 3-6 minutos.

11) Etanol 96º 2 pases de 1 minuto.

12) Xilol 2 pases de 1 minuto.

13) Montar con Eukit.

Esquema:

PROTOCOLO TINCIONES VI GIEMSA

Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas.

Resultados:

• Eritrocitos: Rojo ladrillo
• Núcleos celulares: Morado
• Granulaciones especificas: Rojo, rosa o morado
• Citoplasmas: De rosa al azul (efecto giemsa)
• Hueso: Azul
• Bacterias y parásitos: Azul, menos las rikettsias que se ven violetas

Protocolo:

1) Desparafinar.
En la estufa 10 min a 60ºC o toda la noche a 37ºC.

2) Líquido intermediario, Xiol.

3) Hidratar aplicando alcoholes en concentraciones decrecientes (96% - 50%).

4) Sumergir en agua destilada (o de grifo) para que la muestra se hidrate, ya que la mayoría de los tintes tienen una base acuosa.

5) Solución de Giemsa (filtrada y comercial, o al 30% en agua destilada) durante 1 hora, a Tª ambiente.

6) Se lava con agua hasta que rebose.

7) Lavar con agua acética al 2% varias veces rápidamente, aunque puede llegar hasta 30 segundos (diferenciación)

8) Se lava con agua corriente hasta que rebose

9) Deshidratar con alcohol isopropílico (propanol) (2 cambios al menos) No usar etanol.

10) Se sumerge en las distintas cubetas de xilol durante 5 minutos cada una.

11) Tras este proceso, ya se puede montar
En el montaje, la muestra teñida y humedecida (del coplin de xilol) se cubre con un cristal (cubre) que se pega con producto llamado Entellan, intentando la formación de burbujas de aire, lo que daría lugar a artefactos al observar en el microscopio.

PROTOCOLO TINCIONES VII PAS

La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido periódico (HIO4) de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos hidroxilos (glicoles vecinales).

Esto provoca la formación grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo brillante. 

Entre los componentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina, un componente de la fucsina básica, tratada con ácido sulfúrico; el compuesto final se denomina ácido sulfofucsídico.

Oxidamos los alcoholes que están en posición 1,2 glicol a carbonilo, que reaccionarán con el reactivo de Schiff al haberse convertido en grupos aldehído.

Una gran ventaja de la tinción histoquímica PAS es su capacidad de discriminación de tipos de glúcidos distintos, con pequeñas modificaciones de la técnica.

Reactivos:

1. Ácido Periódico: 0.5 % p/v.
2. Reactivo de Schiff: o Fucsina básica (CI: 42510): 1g. 
3. Solución de agua sulfurosa: o Baño de Ácido Sulfuroso o Agua sulfurosa: o Ácido Clorhídrico (HCl) 1N: 5 ml.
4. Metabisulfito sódico 10 %: 6 ml.
5. Agua (d): 100 ml.
6. Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.

Preparación:

1) Fijación: Formol al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin.

2)Disolver la fucsina en 200 ml de agua destilada hirviendo.

3) Dejar enfriar hasta aproximadamente 50º C. y filtrar

4) Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Después enfriar hasta 25º C y añadir 1g de Bisulfito sódico o Metabisulfito potásico (sódico).

5) Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 días o a veces 24h en tornarse de color amarillo que indica que está listo para su uso.

6) Añadir 2g de carbón activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color.

7) La solución debe conservarse en el refrigerador protegido de la luz.

Técnica de Tinción: 

1) Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)

2) Ácido periódico 0.5 % durante 5 min.

3) Lavar en agua destilada

4) Reactivo de Schiff durante 15- 30 min.

5) Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa durante 2 min. Cada uno.

6) Lavar en agua corriente

7) Colorante de contraste

8) Lavar con agua corriente.

9) Deshidratar, aclarar y montar.  Resultados: Material PAS +: rojo oscuro a magenta. Compuestos PAS +

• Polisacáridos simples: como el glucógeno y la celulosa.
• Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gástrico, en glándulas del duodeno y en cápsulas bacterianas, también en intestino y estómago.
• Mucoproteínas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del árbol respiratorio o bronquial, también la tiroglobulina que está en el tiroides y otras hormonas 
• Glucoproteínas del suero
• Glucolípidos: como los gangliósidos y cerebrosidos.

* Los mucopolisacaridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido periódico y por eso son PAS - (ya que no aparecen los grupos carbonilos)


Controles de la técnica del PAS:

Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los resultados obtenidos, para ello suelen ser muy útiles las técnicas de bloqueo: 

• Bloqueo de grupos aldehídos en general 
• Acetilación de grupos aldehídos situados en posición 1,2 glicol. 

IMÁGENES HISTOLÓGICAS I INTESTINO AZUL ALCIAN.

Tejido: Intestino.

Tinción: Azul alcián.

En el corte histológico podemos diferenciar varias estructuras, como son las células caliciformes teñidas en azul y el vertido de su secreción a a luz intestinal también en este color.

También podemos evidenciar las microvellosidades que en el corte han salido cortadas transversales, por lo que dejan entrever su interior.

En blanco, y manchada por el moco azul, tenemos la luz intestinal.

Corte histológico de intestino 20X.